Ribozyme-mediated CRISPR/Cas9 gene editing in pyrethrum - RNA polymerase II 프로모터를 활용한 표적 유전자 편집의 혁신
본 논문은 전통적인 CRISPR/Cas9 시스템의 한계를 극복하고, 특정 조직 또는 발달 단계에 특이적인 유전자 편집을 가능하게 하는 리보자임 기반의 유전자 편집 기술을 피레트럼(Pyrethrum, Tanacetum cinerariifolium)에서 성공적으로 구현한 연구입니다. 기존의 CRISPR 시스템은 RNA polymerase III(promoter: U6/U3)-의존성으로 인해 조직 특이적 편집에 한계가 있었습니다. 이에 연구팀은 RNA polymerase II 프로모터가 이끄는 리보자임-sgRNA-리보자임(RGR) 인공 유전자를 활용하여, 피레트럼의 국소적 유전자 편집을 실현할 수 있는 새로운 시스템을 개발했습니다. 또한 이 기술을 실현하기 위해 A. rhizogenes 기반의 헤어리 루트 형질전환 시스템을 구축하고, 방어 관련 휘발성 물질인 (E)-β-farnesene을 합성하는 TcEbFS 유전자의 편집을 시도하였습니다. 그 결과, 유전자 편집이 성공적으로 이루어졌으며 해당 화합물의 함량이 유의하게 감소하는 등 기능적 변화도 관찰되었습니다.
연구 배경 및 중요성
CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술은 다양한 작물에서 유전자 기능 연구 및 형질 개선에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 대부분의 시스템은 U6 또는 U3 snRNA 프로모터를 사용하는 RNA polymerase III 기반으로, 조직 특이적 편집에는 적합하지 않습니다. 특히 피레트럼과 같이 유전자 변형이 어려운 식물에서는 이러한 기술적 한계가 더욱 두드러집니다. 이에 따라 RNA polymerase II에 의해 구동되며 리보자임의 자가 절단 기능을 이용한 sgRNA 생성 시스템은 이러한 제약을 극복할 수 있는 대안으로 주목받고 있습니다. 피레트럼은 해충 방지 성분인 피레트린을 생성하는 작물로 생리적 특성에 대한 유전자 기능 연구가 중요하므로, 이 시스템의 도입은 매우 의미 있는 시도라 할 수 있습니다.
연구 목적 및 배경
본 연구는 리보자임 기반 CRISPR/Cas9 시스템을 피레트럼에서 적용 가능하도록 최적화하고, 이 시스템의 효용성을 검증하기 위한 A. rhizogenes 기반의 헤어리 루트 형질전환 시스템을 개발하는 것을 목적으로 합니다. 이 시스템을 바탕으로 (E)-β-farnesene을 생성하는 TcEbFS 유전자를 표적으로 하여 유전자 편집이 실제로 이루어지는지, 그리고 그로 인한 생리적 변화가 존재하는지를 실험적으로 입증하고자 하였습니다.
연구 방법
- 피레트럼 조직 배양 묘의 잎을 이용한 A. rhizogenes 감염을 통해 헤어리 루트 유도
- 지오트로피즘(중력 반응성)의 유무를 통해 Ri 플라스미드 형질전환 선별
- 카나마이신 저항성 선별을 통해 Ti 플라스미드 형질전환 개체 확보
- pBI121 벡터 및 리보자임 기반 CRISPR/Cas9 벡터를 각각 헤어리 루트에 도입
- 유전자 편집 여부는 PCR, 제한효소 절단, 염기서열 분석을 통해 검증
- GC-MS 분석을 통해 (E)-β-farnesene 함량 측정
실험은 약 49일의 과정으로 구성되었으며, 유전자 편집 여부 확인 후 해당 유전자의 기능적 영향까지 함께 분석되었습니다. 특히 BstBI 제한효소를 이용한 절단 부위 손실 분석은 편집 성공 여부를 확인하는 중요한 도구로 활용되었습니다.
주요 발견 및 결과
CRISPR/Cas9 시스템을 적용한 두 개의 헤어리 루트 계통(line A와 line B) 모두 TcEbFS 유전자에 편집이 발생한 것으로 확인되었습니다. 이 편집은 삽입과 결실에 의해 유전자 기능을 변화시켰으며, 결과적으로 (E)-β-farnesene의 생성량이 감소하는 효과가 나타났습니다. 이는 리보자임 기반 시스템이 실제로 유전자 기능을 조절할 수 있음을 의미합니다.
실험 결과 요약
| 샘플 | (E)-β-farnesene 함량 (µg/g FW) | 유전자 편집 여부 |
|---|---|---|
| Control (CK) | 87.19 ± 2.89 | 미발생 |
| Line A | 49.77 ± 1.05 | 발생 |
| Line B | 57.13 ± 0.52 | 발생 |
유전자 편집이 이루어진 두 샘플(line A, B)은 대조군(CK) 대비 (E)-β-farnesene 함량이 유의하게 낮았으며, 이는 편집된 TcEbFS 유전자가 기능을 상실했음을 시사합니다.
한계점 및 향후 연구 방향
본 연구는 편집 성공 여부를 주로 정성적으로 확인하였기 때문에 편집 효율에 대한 정량적 분석은 미비합니다. 또한, 이 시스템은 헤어리 루트 수준에서만 검증되었기 때문에 전체 식물체에서의 적용 가능성은 아직 미지수입니다. 향후에는 조직 특이적 프로모터 다양화, 전체 식물체 전이 실험, CRISPR 효율의 정량적 측정 등이 필요합니다. 아울러 병원체 반응성 프로모터와의 융합을 통해 감염 세포에서만 편집이 일어나는 시스템을 구축하는 것도 매우 유망한 방향입니다.
결론
리보자임 기반의 CRISPR/Cas9 시스템은 RNA polymerase II 프로모터를 통해 조직 특이적 유전자 편집을 가능하게 하며, 피레트럼에서도 이 기술이 실현 가능하다는 것을 본 연구는 성공적으로 보여주었습니다. 특히 A. rhizogenes를 이용한 간단한 형질전환 시스템은 후속 유전자 기능 분석 연구에 큰 도움을 줄 것으로 기대됩니다.
개인적인 생각
기존 CRISPR/Cas9 기술은 뛰어난 범용성을 가졌지만, 식물체 내부에서 특정 조직만을 대상으로 하는 편집에는 한계가 있었습니다. 본 연구는 이러한 기술적 벽을 리보자임이라는 고전적 RNA 절단 기술과 결합함으로써 효과적으로 넘어선 사례로 평가할 수 있습니다. 특히 식물 유전자 기능 연구의 장벽이 높았던 피레트럼에서 이 시스템이 효과적으로 적용되었다는 점은, 향후 다른 고난도 작물에도 유사한 방식이 확산될 수 있음을 시사합니다. 실험 설계도 치밀하며, 유전자 편집 이후의 생리적 변화를 GC-MS로 확인한 부분 또한 신뢰도를 높였습니다.
자주 묻는 질문(QnA)
- Q. 왜 RNA polymerase II 프로모터가 필요했나요?
A. RNA pol II 프로모터는 조직 특이적 발현을 가능하게 하여 원하는 조직에서만 유전자 편집을 유도할 수 있습니다. - Q. 리보자임은 어떤 역할을 하나요?
A. 리보자임은 RNA의 자가 절단 기능을 이용하여, mRNA 구조로부터 sgRNA를 정교하게 분리해주는 역할을 합니다. - Q. 피레트럼은 왜 연구 대상으로 선택되었나요?
A. 피레트럼은 해충 방제 식물로 유전자 조작이 어려워, 새롭고 간단한 형질전환 시스템이 필요한 모델입니다. - Q. 형질전환된 헤어리 루트는 식물 전체의 대안이 될 수 있나요?
A. 헤어리 루트는 부분적인 시스템으로, 전체 식물체에 적용하려면 추가 연구가 필요합니다. - Q. 실험은 얼마나 걸렸나요?
A. A. rhizogenes 형질전환 시스템을 포함해 전체 실험은 약 49일이 소요되었습니다. - Q. (E)-β-farnesene은 어떤 역할을 하나요?
A. 이 화합물은 식물의 해충 저항성과 관련된 휘발성 유기 화합물입니다.
용어 설명
- CRISPR/Cas9: 특정 유전자를 정확하게 제거하거나 수정할 수 있는 유전자 편집 기술
- sgRNA: Cas9 단백질을 특정 DNA 타겟으로 안내하는 RNA 가이드
- RNA polymerase II: mRNA를 합성하는 효소로, 조직 특이적 프로모터와 관련이 많음
- 리보자임(Ribozyme): RNA 자체가 효소 기능을 하여 RNA 절단을 유도하는 구조체
- (E)-β-farnesene: 피레트럼에서 해충을 억제하는 휘발성 화합물
- 헤어리 루트(Hairy root): A. rhizogenes에 의해 유도된 유전자 형질전환 뿌리 조직
- pBI121: GUS 유전자를 포함한 식물 형질전환용 벡터
- CaMV35S 프로모터: 식물에서 강한 발현을 유도하는 범용 프로모터
- BstBI: DNA 내 특정 염기서열을 절단하는 제한효소
- GC-MS: 휘발성 유기 화합물의 정량 및 분석에 사용되는 기기