enChIP systems using different CRISPR orthologues and epitope tags - 논문 리뷰

asdf31sd211 2025. 4. 12.

본 논문은 후지타 토시츠구 박사 연구팀이 개발한 enChIP (engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation) 기술의 확장성과 유연성을 향상시키기 위한 새로운 시스템을 소개한다. enChIP은 특정 유전체 영역을 표지(tagging)하여, 해당 부위에 결합하는 단백질, RNA, DNA 등의 분자 상호작용을 유지한 채로 분리할 수 있는 혁신적인 기술이다. 이 기술은 주로 dCas9와 guide RNA(gRNA)로 구성된 CRISPR 시스템을 기반으로 하며, 이전에는 주로 Streptococcus pyogenes에서 유래한 CRISPR 시스템이 사용되어 왔다. 그러나 본 연구에서는 PAM 서열 제약과 벡터 크기 제한을 극복하기 위해 Staphylococcus aureus 유래 CRISPR 시스템과 다양한 epitope tag를 도입한 새로운 enChIP 시스템을 구축하였다. 이를 통해 기존보다 넓은 유전체 영역을 표적화할 수 있는 가능성을 확보하게 되었으며, 서로 다른 epitope tag를 통해 다단계 분석도 가능해졌다.

연구 배경 및 중요성

유전체 상의 특정 부위에 결합하는 단백질이나 RNA 등 다양한 생체 분자를 규명하는 것은 유전자 조절 메커니즘을 이해하는 데 필수적이다. 이를 위한 기술로 ChIP이 존재하지만, enChIP은 dCas9를 이용한 정밀한 유전체 표지와 강력한 친화정제 기능을 결합하여 보다 높은 특이성과 유연성을 제공한다. 특히, enChIP은 gRNA를 설계하여 원하는 유전체 부위를 자유롭게 표적화할 수 있기 때문에 기존 기술보다 강력한 도구로 평가받는다. 본 연구에서는 S. aureus에서 유래한 dCas9를 활용해 표적 PAM 서열 다양성을 확보하고, epitope tag의 다양화를 통해 실험 목적에 맞는 선택이 가능하도록 시스템을 개선하였다.

연구 목적 및 배경

기존 enChIP 시스템은 Sp-dCas9(3xFLAG)을 중심으로 구축되어 있었으나, 이 시스템은 PAM 서열(5'-NGG-3') 제약으로 인해 일부 유전체 영역을 표적화하기 어렵다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위해 본 연구는 S. aureus 유래 dCas9(Sa-dCas9)을 도입하고, 이를 3xFLAG tag와 결합한 새로운 enChIP 시스템을 제작하였다. 더불어, 동일한 Sp-dCas9를 2xAM-tag로 변형하여 서로 다른 epitope tag를 사용할 수 있는 enChIP 시스템을 병렬적으로 구성하였다. 이러한 시스템은 향후 다단계 분석이나 배경신호 감소 등 응용 확대에 도움이 될 수 있다.

연구 방법

Sa-dCas9-3xFLAG 또는 Sp-dCas9-2xAM을 발현하는 플라스미드 제작
HEK293T 또는 HT1080 세포에 해당 플라스미드 및 IRF-1 유전자 프로모터를 타겟하는 gRNA를 도입
크로스링크 및 크로마틴 분절 후, epitope tag에 대한 항체를 이용한 면역침강 수행
정제된 크로마틴 복합체에서 실시간 PCR로 표적 유전자(예: IRF-1) 회수량 평가
Western blot을 통해 단백질 발현 여부 확인

gRNA는 인간 IRF-1 프로모터를 표적하며, Sa-dCas9과 Sp-dCas9 각각에 적합한 gRNA를 사용하였다. 플라스미드는 Addgene에서 제공되는 다양한 벡터를 기반으로 제작되었으며, 발현 확인은 항-FLAG 또는 항-AM-tag 항체를 사용한 면역블롯으로 진행되었다.

주요 발견 및 결과

Sa-dCas9-3xFLAG 시스템은 Sp-dCas9-3xFLAG 시스템과 유사한 수준의 enChIP 효율을 보였으며, IRF-1 프로모터에 대한 특이적인 회수능을 확인하였다. 또한, lentivirus 시스템을 통한 Sp-dCas9-2xAM의 안정적 발현에서도 동일한 표적에 대한 높은 회수 효율을 나타냈다. 이는 두 시스템이 모두 enChIP 분석에 효과적으로 활용될 수 있음을 시사하며, 상호 보완적 사용을 통해 백그라운드 신호 감소, 다중 표적 분석 등이 가능할 것으로 예상된다.

실험 결과 요약

CRISPR 시스템	Tag	세포주	gRNA 유무	IRF-1 회수율 (% input)
Sp-dCas9	3xFLAG	293T	O	약 18%
Sa-dCas9	3xFLAG	293T	O	약 15~18%
Sp-dCas9	2xAM	HT1080	O	약 4.5%

표에 따르면 두 시스템 모두 gRNA가 존재할 때만 IRF-1 프로모터 회수가 가능하였고, 무관한 유전자인 SOX2는 회수되지 않아 특이성이 높음을 입증하였다.

한계점 및 향후 연구 방향

Sa-dCas9-3xFLAG 시스템은 아직 안정적 세포주로 확립되지 않았으며, 대규모 분석(NGS, MS)에서의 성능은 미확인 상태이다. 향후 연구에서는 두 시스템을 조합한 다단계 enChIP 분석, 각 시스템의 오프타겟 평가, 비분열 세포에의 적용 가능성 등을 중심으로 추가 검증이 필요하다. 또한, 다른 epitope tag 또는 CRISPR orthologue의 적용 가능성도 향후 기술 발전의 열쇠가 될 수 있다.

결론

본 연구는 S. aureus 유래 dCas9와 3xFLAG, 그리고 S. pyogenes 유래 dCas9와 2xAM-tag을 각각 활용한 enChIP 시스템을 개발하고, 이들이 모두 높은 특이성과 효율을 바탕으로 표적 유전체 영역을 분리할 수 있음을 입증하였다. 이는 enChIP 기술의 적용 범위를 넓히고, 다중 분석 및 표적 다양화를 가능케 하는 중요한 기반 기술로 자리잡을 수 있을 것이다.

개인적인 생각

이 연구는 실험기술적 확장성을 고민하는 분자생물학 연구자들에게 매우 유용한 사례로 보인다. 특히 epitope tag와 CRISPR orthologue를 조합하여 시스템의 유연성을 확보한 점은 실험 설계에 큰 폭의 자유도를 제공한다. 향후 이 기술이 세포 내 특정 구조물 분석, 유전자 조절 기전 연구, 그리고 약물 표적 탐색 등 다양한 분야로 확장될 수 있으리라 본다. 개인적으로는 이중 크로마틴 침강(enChIP-seq + proteomics)을 통한 정밀 생체 네트워크 규명 분야에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q: enChIP이란 무엇인가요?
A: 특정 유전체 부위를 표지한 뒤, 해당 부위와 상호작용하는 분자를 함께 정제하여 분석하는 기술입니다.
Q: dCas9은 무엇인가요?
A: Cas9의 절단 능력을 제거한 형태로, DNA를 자르지 않고 결합만 하여 위치를 표지하는 역할을 합니다.
Q: Sp-dCas9과 Sa-dCas9의 차이는 무엇인가요?
A: 유래된 균주가 다르며, PAM 서열이 달라 서로 다른 DNA 표적에 접근할 수 있습니다.
Q: epitope tag는 왜 필요한가요?
A: 단백질을 항체로 인식하여 정제하기 위한 표지로 사용되며, enChIP에서 핵심적 역할을 합니다.
Q: 3xFLAG와 2xAM의 차이는 무엇인가요?
A: 각각 다른 항체로 정제할 수 있도록 구성된 tag로, 다중 실험이나 백그라운드 감소에 유리합니다.
Q: Sa-dCas9 시스템은 언제 유리한가요?
A: NGG PAM이 없는 부위를 표적화해야 하거나, 작은 크기의 플라스미드가 필요한 경우 유리합니다.

용어 설명

enChIP: dCas9 등의 DNA 결합 단백질을 이용해 특정 유전자 부위를 정제하는 기술
dCas9: DNA는 인식하되 자르지 않는 돌연변이형 Cas9 단백질
gRNA: 유전자를 표적화하기 위한 가이드 RNA
PAM: CRISPR 시스템이 DNA를 인식할 수 있도록 하는 특정 서열
3xFLAG: FLAG 항체에 인식되는 세 번 반복된 epitope tag
2xAM-tag: AM-tag 서열을 두 번 반복한 epitope tag로, 별도의 항체를 통해 정제 가능
HEK293T: 인간 배아 신장 세포에서 유래한 널리 쓰이는 세포주
HT1080: 인간 육종 암세포에서 유래한 세포주
Lentivirus: 유전자 전달에 쓰이는 바이러스로, 분열하지 않는 세포도 감염 가능
Crosslinking: 단백질-DNA 상호작용을 고정시키기 위한 화학적 처리