Establishment of a PEG-mediated protoplast transformation system based on DNA and CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes for banana: 바나나 유전자 편집을 위한 비DNA 기반 시스템 개발

asdf31sd211 2025. 5. 10.

본 연구는 바나나에서 DNA를 이용하지 않고 유전자 편집을 가능하게 하는 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체 기반의 PEG 매개 원형질체(protoplast) 형질전환 시스템을 수립하고 최적화한 최초의 보고이다. 기존의 바나나 유전자 편집 연구는 대부분 아그로박테리움을 이용한 T-DNA 삽입 방식에 의존했으며, 이로 인해 외래 DNA의 제거가 어려운 문제가 있었다. 이에 반해 본 연구는 PEG를 이용하여 DNA 없이 RNP를 바나나 원형질체에 직접 도입함으로써, 유전적으로 변형되지 않은(non-transgenic) 식물체를 생성할 가능성을 열었다. 다양한 실험을 통해 PDS 유전자(target gene)에 대한 sgRNA의 효과를 검증하고, Cas9 및 Cas12a 시스템 간의 효율 차이도 분석하였다. 또한 PCR-RE, Sanger 시퀀싱, 그리고 딥 앰플리콘 시퀀싱을 활용해 편집 효율 및 오프타겟 가능성을 정밀히 평가하였다.

연구 배경 및 중요성

바나나는 세계적으로 중요한 열대작물이며, 대부분의 재배 품종은 무종자성 3배체로 전통적인 교배 육종이 매우 어렵다. 따라서 유전자 편집을 통한 품종 개량이 필수적인 대안으로 떠오르고 있다. 그러나 기존의 CRISPR/Cas9 기반 편집은 DNA 삽입이 동반되어 비유전자변형체(non-GMO)로 간주되지 못하는 단점이 있다. 본 연구는 PEG를 이용한 비DNA 기반의 RNP 전달 시스템을 수립함으로써, 이러한 한계를 극복하고 바나나 유전자 편집 기술의 실용화를 위한 중요한 전기를 마련하였다.

연구 목적 및 배경

이 연구의 목적은 다음과 같다: (1) 바나나 원형질체를 이용한 PEG 기반 형질전환 시스템 수립, (2) CRISPR/Cas9 및 Cas12a 시스템의 효율 비교, (3) DNA가 삽입되지 않는 RNP 기반 유전자 편집의 가능성 검증, (4) sgRNA의 유효성 검증을 위한 플랫폼 제공, (5) 바나나 유전자 편집의 비트랜스제닉 접근 가능성 평가.

연구 방법

바나나 유도 배아 세포로부터 원형질체를 효소 처리로 분리
PEG 농도와 반응 시간을 조절하여 최적의 형질전환 조건 확립
pUbi-GFP를 이용한 형질전환 효율 측정 (유세포 분석)
PDS 유전자에 대한 sgRNA를 설계하고 Cas9/Cas12a 플라스미드 또는 RNP와 함께 도입
PCR-RE, Sanger 시퀀싱 및 딥 앰플리콘 시퀀싱으로 편집 여부와 효율 분석

형질전환은 PEG 50% 조건, 30분 반응 시간에서 가장 높은 효율(5.6%)을 나타냈으며, 유전자 편집 효율은 딥 시퀀싱을 통해 분석되었다.

주요 발견 및 결과

PEG를 통한 바나나 원형질체 형질전환 시스템은 RNP 복합체 및 DNA 기반 플라스미드를 모두 성공적으로 전달할 수 있었으며, 특히 CRISPR/Cas9-RNP 시스템은 DNA 삽입 없이도 유전자 편집이 가능함을 증명하였다. Cas9 플라스미드를 통한 편집 효율은 최대 1.04%, RNP 시스템은 최대 0.92%, Cas12a는 최대 0.39%로 나타났다. 또한 RNP 시스템은 0.01% 수준의 매우 낮은 오프타겟 편집만을 보였다.

실험 결과 요약

시스템	최고 편집 효율	평균 효율	오프타겟률
Cas9 플라스미드	1.04%	약 0.6%	0.01%
Cas9-RNP	0.92%	약 0.5%	0.01%
Cas12a 플라스미드	0.39%	약 0.2%	분석 안됨

Cas9 기반 시스템이 전반적으로 가장 높은 편집 효율을 나타냈으며, RNP 시스템은 오프타겟 최소화 측면에서 유리한 대안을 제시하였다.

한계점 및 향후 연구 방향

가장 큰 한계는 바나나 원형질체로부터의 식물체 재생률이 매우 낮고, 안정적인 재현이 어렵다는 점이다. 따라서 향후 연구는 RNP 처리 후 재분화 및 식물체 재생 조건의 개선에 집중되어야 하며, 이를 통해 실제 비DNA 기반 품종 개량이 실현될 수 있다. 또한 다양한 유전자 타겟에 대한 적용성과 다양한 품종에 대한 보편성 확보도 필요하다.

결론

본 연구는 바나나에서의 CRISPR/Cas9-RNP 기반 유전자 편집이 가능함을 입증한 획기적인 사례이다. PEG를 활용한 원형질체 형질전환 시스템은 sgRNA 스크리닝, 유전자 기능 연구, DNA 없는 유전자 편집 응용에 매우 유용한 도구로 활용될 수 있다. 바나나 품종 개량에 있어 비트랜스제닉 방식의 현실화를 위한 첫걸음으로 평가된다.

개인적인 생각

본 논문은 식물 유전자 편집 기술이 단순히 유전체 내 특정 유전자의 기능을 확인하는 수준을 넘어서, 실제로 비유전자변형 품종을 개발하기 위한 현실적인 가능성을 보여주었다는 점에서 매우 주목할 만하다. 특히 바나나처럼 전통 육종이 불가능한 작물에서, RNP 기반의 비DNA 편집 기술은 향후 농업 생명공학의 핵심 도구가 될 것이다. 다만 실용화를 위해서는 원형질체로부터의 식물체 재생률 향상이라는 중요한 기술적 도약이 필요하며, 이를 위한 후속 연구가 기대된다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q: RNP란 무엇인가요?
A: Cas9 단백질과 sgRNA가 결합된 복합체로, 외부 DNA 없이 유전자 편집을 수행할 수 있습니다.
Q: PEG는 어떤 역할을 하나요?
A: 원형질체 세포막을 일시적으로 열어 외부 분자가 세포 내로 들어갈 수 있도록 도와주는 물질입니다.
Q: 왜 DNA 삽입 없는 방식이 중요한가요?
A: GMO(유전자변형생물체) 규제를 피하고 소비자 수용성을 높일 수 있기 때문입니다.
Q: PDS 유전자는 왜 타겟으로 선택되었나요?
A: 변이가 생기면 알비노(백화) 표현형이 나타나 쉽게 식별 가능하기 때문입니다.
Q: Cas12a는 Cas9과 무엇이 다른가요?
A: Cas12a는 다른 PAM 서열을 인식하며, 절단 부위의 차이가 있습니다.
Q: 오프타겟이란 무엇인가요?
A: 목표하지 않은 유전자 부위에 비의도적으로 편집이 발생하는 현상입니다.

용어 설명

원형질체 (Protoplast): 식물 세포벽이 제거된 세포로, 유전물질 전달 실험에 주로 사용됨.
PEG (Polyethylene Glycol): 세포막을 투과시켜 DNA나 단백질을 세포 내로 전달하는 화학물질.
CRISPR/Cas9: 유전자 타겟을 인식하고 절단하여 편집하는 유전자 가위 시스템.
RNP (Ribonucleoprotein): Cas9 단백질과 sgRNA가 결합된 복합체.
sgRNA (Single guide RNA): Cas9이 목표 DNA를 인식하게 해주는 RNA.
PDS 유전자: 광합성 관련 유전자로, 돌연변이 시 알비노 현상이 나타남.
딥 앰플리콘 시퀀싱: 목표 유전자 영역을 정밀하게 분석하는 차세대 염기서열 분석 기법.
Cas12a: Cas9과 유사한 유전자 편집 효소이지만, 절단 메커니즘과 PAM 인식이 다름.
오프타겟 효과: 유전자 편집 도구가 원하지 않는 부위를 절단하는 비의도적 효과.
비트랜스제닉 (Non-transgenic): 외래 DNA가 유전체에 삽입되지 않은 생물체.