Characterization of MAP c21873-1 as a new counter-selectable marker for unmarked genetic modification of Pichia pastoris

asdf31sd211 2025. 5. 8.

본 논문은 진핵세포 발현 시스템으로 널리 활용되는 *Pichia pastoris*에서 효율적이고 무표식(unmarked) 유전자 편집을 가능하게 하는 새로운 counter-selectable marker 시스템을 개발한 연구이다. 기존의 MazF 독소 유전자를 기반으로 한 시스템은 프로모터 누출(leaky expression)로 인해 세포 생장을 저해하고, 유전적 조작이 어려웠던 단점을 가진다. 이를 극복하기 위해 연구진은 식물 리보솜 불활성화 단백질(RIP) 계열의 Mirabilis antiviral protein(MAP) 중 c21873-1을 새롭게 발굴하고 이를 counter-selectable marker로 활용하였다. 이 시스템은 유전자 삽입 후 selection marker를 효율적으로 제거할 수 있으며, BmT1 위치에서 14kb의 대형 삽입도 문제없이 수행되었다. 또한 c21873-1은 낮은 누출 독성과 높은 통제력을 기반으로 Pichia에서 seamless한 유전자 통합을 가능하게 하였다.

연구 배경 및 중요성

*Pichia pastoris*는 메틸영양성 진균으로, 고수준의 이종 단백질을 발현할 수 있는 시스템으로 제약 및 산업 분야에서 널리 활용되고 있다. 그러나 이 효모는 안정적인 자연 플라스미드를 가지지 않기 때문에 외래 유전자 삽입을 위해 유전체 수준의 편집이 필수적이다. 기존의 유전자 조작 방법은 Cre/loxP나 FLP/FRT 시스템을 기반으로 하지만, 유전체 내에 불필요한 서열이 남아 여러 번의 조작에 제약이 생기게 된다. 또한, URA3 기반 counter-selection 시스템은 유전적 제약(ura3 돌연변이 필요)과 생장 지연 등 실험적 불편함을 동반한다. 따라서, 효율적이며 scarless한 유전자 편집이 가능한 새로운 시스템의 개발이 절실하다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 목적은 기존의 MazF 기반 counter-selection 시스템의 단점을 극복할 수 있는 새로운 선택 마커를 개발하고, 이를 활용하여 대형 외래 유전자의 seamless한 삽입과 selection marker 제거가 가능한 시스템을 구축하는 것이다. 이를 위해 Mirabilis jalapa에서 새롭게 발굴한 MAP c21873-1 및 c21873-1T, 기존 보고된 c23467을 비교 대상으로 선정하였으며, 다양한 프로모터(PDAS1, PDAS2, PFDH1)의 누출 수준과 유도력을 검토하여 적절한 조합을 확립하였다.

연구 방법

여섯 개의 *P. pastoris* 유래 유도성 프로모터의 누출 발현 분석 (EGFP 리포터 이용)
MAP 유전자 (c21873-1, c21873-1T, c23467)를 counter-selectable marker로 플라스미드 구성
Pcsk2, kex2, EGFP 등 다양한 표적 유전자의 BmT1 부위 통합 실험 수행
단일 교차적 상동재조합(HR)을 이용한 유전자 삽입
메탄올 유도 하에서 marker 유도 발현 및 내부 HR을 통한 marker 제거
EGFP 형광 분석 및 흐름세포분석(FCM)을 통한 발현 평가

세균 및 효모에서 다양한 프로모터의 누출 여부를 확인한 후, 독성이 낮고 유도력이 강한 PDAS2 프로모터를 최종적으로 선택하였다. MAP 유전자는 Hygromycin B 내성 유전자 및 표적 유전자와 함께 삽입되어, BmT1 부위에 단일 교차로 삽입되었다. 삽입 여부는 PCR 및 염기서열 분석으로 확인되었으며, 메탄올 배지에서의 counter-selection을 통해 marker 제거를 확인하였다.

주요 발견 및 결과

MAP c21873-1 및 c21873-1T는 기존의 MazF보다 낮은 독성과 높은 삽입 효율을 보였다. 특히 PDAS2 프로모터 하에서 이들 marker는 매우 안정적으로 발현되며, 삽입된 유전자(pcsk2, kex2, egfp 등)는 성공적으로 발현되었다. c21873-1과 PDAS2 조합은 100%의 marker 제거율을 보였고, 최대 45%에 이르는 삽입 효율도 확인되었다. 반면, c23467은 P. pastoris에서 높은 독성을 나타내어 실험적으로 부적합했다.

실험 결과 요약

조합	삽입 유전자	프로모터	삽입 효율 (%)	Marker 제거율 (%)
c21873-1	pcsk2	PDAS2	45%	100%
c21873-1T	kex2	PDAS2	35%	100%
c23467	pcsk2/kex2	PFDH1	0%	0%

위 표는 다양한 MAP 조합과 프로모터 환경에서 유전자 삽입 효율 및 marker 제거율을 요약한 것이다. c21873-1 기반 시스템이 가장 우수한 성능을 보였다.

한계점 및 향후 연구 방향

본 시스템은 성공적인 무표식 유전자 편집 전략을 제시했지만, 삽입 위치(BmT1)가 일부 단백질의 분비 발현에는 부적절할 수 있다는 제한이 존재하였다. 향후 연구에서는 다양한 유전체 위치에 대한 통합 효율 및 발현 분석이 필요하며, MAP c21873-1의 응용 가능성을 다른 진균 또는 진핵 모델로 확장하는 연구가 요구된다.

결론

MAP c21873-1은 *Pichia pastoris*에서 높은 효율로 무표식 유전자 삽입 및 marker 제거를 가능케 하는 새로운 counter-selectable marker로서 유망성을 입증하였다. 본 전략은 유전자 삽입, 제거, 돌연변이 도입 등 다양한 유전공학적 조작에서 활용될 수 있으며, 타 유기체로의 응용 가능성도 매우 높다.

개인적인 생각

이 연구는 단순히 새로운 marker 유전자를 소개한 것을 넘어, 실질적으로 대형 유전자의 삽입과 marker 제거를 가능하게 한 점에서 실용적 의미가 크다. 특히 MazF의 높은 독성으로 인한 유전조작 실패라는 흔한 문제를 극복하며, PDAS2와 c21873-1 조합의 안정성은 인상적이었다. 향후 산업용 유전자 조작 시스템에서도 적용 가능성이 크며, plant-derived RIP 계열 단백질의 새로운 활용성을 보여준 매우 흥미로운 연구라고 생각한다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q. MAP c21873-1은 기존 MazF보다 어떤 점이 더 우수한가요?
A. 세포 독성이 낮고 프로모터 누출에 덜 민감하여 유전자 조작에 더 적합합니다.
Q. PDAS2 프로모터는 왜 선택되었나요?
A. 누출 발현이 매우 낮고, 메탄올 유도에 의해 강한 발현이 가능하기 때문입니다.
Q. 본 시스템은 어떤 유전자 길이까지 삽입 가능한가요?
A. 최대 14kb 길이의 삽입이 성공적으로 수행되었습니다.
Q. c23467는 왜 사용되지 않았나요?
A. 높은 독성으로 인해 *P. pastoris*에서 세포 생장을 저해하였기 때문입니다.
Q. 이 시스템은 다른 진균에도 적용 가능할까요?
A. 가능성이 매우 높으며, 추후 연구에서 다양한 종으로 확장될 수 있습니다.
Q. 삽입된 유전자는 어떤 방식으로 발현되었나요?
A. EGFP, ERp46, P4HB 등이 BmT1 위치에서 내재적으로 발현되었으며, 세포 내 발현이 확인되었습니다.

용어 설명

Pichia pastoris: 메틸영양성 진균으로, 고수준 이종 단백질 발현 시스템에 활용되는 효모.
Counter-selectable marker: 특정 조건에서 발현 시 세포 생장을 억제하여 selection 후 제거 가능한 마커 유전자.
MAP (Mirabilis Antiviral Protein): 식물 유래 리보솜 불활성화 단백질로, 단백질 합성을 억제함.
RIP (Ribosome-Inactivating Protein): 리보솜의 rRNA를 절단해 단백질 합성을 막는 독성 단백질 계열.
MazF: E. coli 유래 독소 단백질로, mRNA의 ACA 염기서열을 절단하여 세포사를 유도함.
HR (Homologous Recombination): 상동 유전체 서열을 이용하여 유전자 삽입 또는 삭제를 유도하는 방법.
BmT1 locus: P. pastoris 유전체 내 표적 유전자 삽입에 사용되는 특정 위치.
EGFP: Enhanced Green Fluorescent Protein. 형광 관찰이 가능한 리포터 단백질.
PDAS2: 낮은 누출 발현과 높은 유도성을 가진 P. pastoris 유래 유도형 프로모터.
Seamless Integration: 외부 유전자 삽입 시 불필요한 잔여 서열 없이 삽입하는 방법.