CRISPR/Cas9-mediated knockout of clinically relevant alloantigenes in human primary T cells - 논문 리뷰

asdf31sd211 2025. 4. 19.

이 논문은 인간 T 세포에서 임상적으로 중요한 동종 항원의 유전자 제거를 CRISPR/Cas9 기술로 수행하는 방법에 대한 실험적 검증을 담고 있다. 특히, 이 연구는 자가 유래 T 세포의 한계를 극복하고 동종유래(allogeneic) T 세포를 면역치료에 활용하기 위한 기반기술로서 TRAC 유전자(TCRα 구성 요소)와 CD52 유전자의 제거 가능성을 탐색한다. 연구진은 바이러스 기반 도입이 아닌, 전기천공(electroporation)을 통한 CRISPR/Cas9 플라스미드 전달 방식을 선택하여 안정성과 단순성을 확보하고자 하였으며, 그 결과 TCR 및 CD52 단백질의 표면 발현이 약 7~8% 감소한 것을 확인하였다. 이 연구는 저비용, 고안정성의 유전자 편집 플랫폼을 이용한 동종 T 세포 조작의 가능성을 제시한 중요한 사례로 평가된다.

연구 배경 및 중요성

암 면역치료 분야에서는 환자 자신의 T 세포를 이용하는 자가유래 방식이 일반적이다. 하지만 이 방식은 제조 시간, 비용, T 세포의 품질과 양 등에서 많은 제약을 가진다. 이에 대한 대안으로 건강한 기증자로부터 얻은 동종유래 T 세포를 사용하는 접근이 주목받고 있으며, 이를 위해서는 수혜자에게 면역 반응을 일으키지 않도록 특정 유전자를 제거하는 것이 중요하다. 특히, 이식편대숙주질환(GvHD)을 유발할 수 있는 TCR 유전자와, 수혜자의 면역계가 공여 세포를 제거하지 못하도록 하는 CD52 유전자가 주요 타겟이다. 본 연구는 이러한 유전자들을 효율적으로 제거하기 위해 CRISPR/Cas9 기반의 플라스미드 전달 방식을 적용하였다.

연구 목적 및 배경

본 연구의 주요 목적은 전기천공을 통해 전달된 CRISPR/Cas9 플라스미드가 인간 T 세포에서 TRAC 및 CD52 유전자를 얼마나 효과적으로 제거할 수 있는지를 검증하는 것이다. 바이러스 전달 시스템과 달리 플라스미드 기반 방법은 유전자 삽입 위험이 없으며 생산이 쉽고 경제적이지만, 실제 T 세포에서의 편집 효율은 충분히 검증되지 않았다. 따라서 본 연구는 이 시스템의 타당성과 한계를 실험적으로 입증하고자 했다.

연구 방법

TRAC 및 CD52 유전자의 첫 번째 엑손을 타겟으로 하는 gRNA 설계
gRNA를 포함하는 Cas9 발현 플라스미드를 제작 (pSpCas9-2A-GFP)
293T 세포를 이용한 플라스미드 기능성 검증 (TIDE 및 IDAA 분석)
활성화된 인간 주요 T 세포에 전기천공 기반 플라스미드 도입
유전자 편집 후 단백질 발현 분석 (유세포분석법)

293T 세포에서 플라스미드의 효율을 먼저 확인한 후, 동일한 조건으로 인간 주요 T 세포에 플라스미드를 전달하였다. 유전자 편집 효율은 DNA 분석(TIDE 및 IDAA) 및 단백질 수준에서의 발현 감소로 평가되었다.

주요 발견 및 결과

293T 세포에서는 TRAC과 CD52 유전자 모두에서 1bp 삽입을 중심으로 한 60~89%의 유전자 편집 효율이 확인되었다. 이어진 T 세포 실험에서는 해당 유전자에 대한 12~14%의 프레임시프트(indel)가 확인되었고, 이 결과는 단백질 수준에서 각각 약 7~8%의 표면 발현 감소로 이어졌다. 특히 TRAC 유전자가 제거되면 CD3 단백질이 동시에 사라지며, 이는 TCR 복합체의 기능 상실을 의미한다.

실험 결과 요약

타겟 유전자	편집 효율 (Indel, T세포 기준)	표면 단백질 발현 감소율
TRAC	14.3%	7.1%
CD52	12.5%	7.8%

유전자 편집은 대부분 단일 1bp 삽입 형태로 발생했으며, 이는 비상동 말단 연결(cNHEJ)에 의해 주도된 것으로 추정된다. 이러한 결과는 T 세포 내 세포주기 상태 및 p53 의존적 반응의 영향을 받은 것으로 해석된다.

한계점 및 향후 연구 방향

플라스미드 기반 CRISPR/Cas9 전달 방식은 제작이 간편하고 저렴하지만, T 세포에서의 낮은 전달 효율과 유전자 편집 효율이라는 한계를 지닌다. 특히 DNA 독성과 면역 반응 유발 가능성이 주요 제약 요인이다. 따라서 향후에는 RNP 기반 전달법을 통한 고효율 편집, 혹은 FACS 기반으로 Cas9 발현 수준을 정밀 조절하는 방법 등을 통해 문제를 극복해야 할 것이다. 또한 복수 유전자 동시 편집을 위한 다중 gRNA 적용 연구도 병행되어야 한다.

결론

본 연구는 플라스미드 기반 CRISPR/Cas9 전달 시스템이 인간 주요 T 세포에서 TRAC 및 CD52 유전자를 편집하는 데 기술적으로 가능하다는 것을 입증하였다. 편집 효율은 임상 적용에 요구되는 수준에는 미치지 못하지만, 저비용 대안으로서 기초연구 단계에서는 유용하게 활용될 수 있다. 향후 이 방법을 고도화하거나 RNP 기반 시스템으로 전환하는 과정이 이어져야 실제 치료 응용으로 발전할 수 있을 것이다.

개인적인 생각

이 논문은 고비용, 고위험의 바이러스 전달 방식을 피하면서도 T 세포 유전자 편집을 실현하려는 시도로 매우 의미가 있다. 비록 편집 효율은 낮았지만, 전기천공 플라스미드를 통한 T 세포 편집의 실현 가능성을 직접 실험으로 입증했다는 점에서 학술적 가치가 높다. 특히, 유전자 편집 기술의 실제 적용은 실험실을 넘어 임상으로 확장될 수 있어야 하며, 이를 위한 기초적 데이터가 절실히 필요하다. 이 연구는 그러한 기초 자료로서 향후 연구자들에게 실질적인 방법론적 토대를 제공할 수 있을 것으로 본다. 플라스미드 기반 편집법의 단점을 극복하기 위한 후속 연구들이 활발히 이어지길 기대한다.

자주 묻는 질문(QnA)

Q: 왜 TRAC 유전자를 타겟으로 했나요?
A: TRAC 유전자는 TCRα를 구성하는 유전자로, 이를 제거하면 전체 TCR 복합체 기능을 비활성화할 수 있습니다.
Q: CD52 유전자를 제거하는 이유는 무엇인가요?
A: CD52를 제거하면 항-CD52 항체 기반 림프구 제거 요법에도 살아남을 수 있어 공여 세포의 생존률이 높아집니다.
Q: 플라스미드 기반 전달 방식의 장점은 무엇인가요?
A: 저비용, 간단한 제작, 유전자 삽입 위험 없음 등의 장점이 있습니다.
Q: 플라스미드 기반 방식의 단점은 무엇인가요?
A: T 세포에서 전달 효율과 편집 효율이 낮으며, DNA 독성 문제도 존재합니다.
Q: TCR을 제거하면 T 세포 기능은 어떻게 되나요?
A: TCR과 함께 CD3 발현도 사라지며, 일반적인 항원 인식 기능은 소실됩니다.
Q: RNP 방식은 어떤 면에서 유리한가요?
A: 효율이 높고 DNA 독성이 없으며, 동시에 여러 유전자를 타겟팅할 수 있는 장점이 있습니다.

용어 설명

CRISPR/Cas9: 특정 DNA 서열을 절단하는 유전자 편집 기술
TCR: T 세포 수용체, 항원을 인식하는 단백질 복합체
CD52: T 세포 표면 단백질로, 면역 억제 항체의 타겟
TRAC: TCRα 유전자를 구성하는 핵심 유전자
Indel: 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 형태의 돌연변이
NHEJ: 비상동 말단 연결, DNA 복구 경로 중 하나
MMEJ: 미세상동 말단 연결, 다른 형태의 DNA 복구 경로
Electroporation: 세포막에 전기 충격을 가해 외부 물질을 전달하는 기술
FACS: 유세포 분석기, 세포의 표면 단백질 발현을 정량 분석함
RNP: 리보핵단백질 복합체, Cas9 단백질과 gRNA가 결합된 형태